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簡要描述:聚合酶鏈鎖反應(yīng),Polymerase chain reaction,簡稱PCR,是一種分子生物學(xué)技術(shù),用于擴增特定的DNA-片段,這種方法可在生物體外 進行,不必依賴大腸桿菌或酵母菌等生物體。PCR這項技術(shù),被廣泛地運用在醫(yī)學(xué)和生物學(xué)的實驗室,例如用于判斷檢體中是否會表現(xiàn) 某遺傳疾病的圖譜、傳染病的診斷、基因復(fù)制,以及親子鑒定。濟南PCR實驗室裝修工程 設(shè)計規(guī)劃
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詳細介紹
品牌 | 其他品牌 | 產(chǎn)地類別 | 國產(chǎn) |
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應(yīng)用領(lǐng)域 | 醫(yī)療衛(wèi)生,生物產(chǎn)業(yè) |
濟南PCR實驗室裝修工程 設(shè)計規(guī)劃
PCR實驗室污染主要是下面四個方面
(一) 標本間交叉污染:標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導(dǎo)致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導(dǎo)致彼此間的污染。
(二) PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
(三) PCR擴增產(chǎn)物污染:這是PCR反應(yīng)中主要的常見污染問題。因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml),遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽就可形成假陽性。
還有一種容易忽視,可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。
(四) 實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見,因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。
污染的監(jiān)測
一個好的實驗室,要時刻注意污染的監(jiān)測,考慮有無污染是什么原因造成的污染,以便采取措施,防止和消除污染。
對照試驗
1、陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性 對照要選擇擴增度中等、重復(fù)性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100個拷貝以下)。但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大.因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定,檢驗人員心中有數(shù)時,在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。
2、陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監(jiān)測試劑是否污染。
3、重復(fù)性試驗
4、選擇不同區(qū)域的引物進行PCR擴增
防止污染的方法
進行PCR操作時,操作人員應(yīng)該嚴格遵守一些操作規(guī)程,大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn)。
(一) 劃分操作區(qū):目前,普通PCR尚不能做到單人單管,實現(xiàn)*閉管操作,但無論是否能夠達到單人單管,均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行,PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行:
1. 試劑準備區(qū)。
2.標本制備區(qū)。
3. PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。
各工作區(qū)要有一定的隔離,操作器材,要有一定的方向性。如:試劑準備→標準制備→PCR擴增區(qū)及分析區(qū)。
切記:任何一間的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。
(二) 分裝試劑:PCR擴增所需要的試劑均應(yīng)在生物安全柜、裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中,不能用來吸取擴增后的DNA和其他來源的DNA:
1.PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水;
2.引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴增產(chǎn)物區(qū)配制;
3.引物和dNTP應(yīng)分裝儲存,分裝時應(yīng)標明時間,以備發(fā)生污染時查找原因。
(三) 實驗操作注意事項
盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因,樣品間的交叉污染也是原因之一。因此,不僅要在進行擴增反應(yīng)是謹慎認真,在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意:
1. 戴一次性手套,若不小心濺上反應(yīng)液,立即更換手套;
2. 使用一次性吸頭,嚴禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用,吸頭不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染;
3. 避免反應(yīng)液飛濺,打開反應(yīng)管時為避免此種情況,開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面;
4. 操作多份樣品時,制備反應(yīng)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然后分裝,這樣即可以減少操作,避免污染,又可以增加反應(yīng)的精確度;
5. 后加入反應(yīng)模板,加入后蓋緊反應(yīng)管;
6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照,即可驗證PCR反應(yīng)的可靠性,又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性;
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA的污染,z-ui好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器,至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該,不能交叉使用,尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū);
8. 重復(fù)實驗,驗證結(jié)果,慎下結(jié)論。
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